مراحل pcr

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، تکنیکی است که برای ساخت سریع و دقیق تعداد زیادی از قطعه خاصی از DNA استفاده می شود. ساخت و نصب سکوبندی ازمایشگاهی واکنش زنجیره ای پلیمراز محققان را قادر می سازد مقادیر زیادی DNA را که برای آزمایش ها و روش های مختلف زیست شناسی مولکولی، تجزیه و تحلیل پزشکی قانونی، زیست شناسی تکاملی و تشخیص پزشکی مورد نیاز است، بدست آورند.

PCR در سال 1983 توسط کاری بی مولیس، بیوشیمیست آمریکایی که به دلیل اختراع خود برنده جایزه نوبل شیمی شد، ساخته شد. قبل از توسعه PCR، روش های مورد استفاده برای تقویت یا تولید قطعات DNA نوترکیب وقت گیر و پرمشغله بودند. ولی در مقابل، ماشینی که برای انجام واکنش های PCR طراحی شده است می تواند میلیاردها نسخه از قطعه DNA را فقط در چند ساعت تولید کند.

چگونگی روند PCR

PCR یک فرآیند سه مرحله ای است که در چرخه های مکرر در دستگاه ترمال سایکلر انجام می شود. مرحله اولیه دناتوراسیون یا جداسازی دو رشته مولکول DNA است. این امر با گرم کردن ماده اولیه تا دمای حدود 95 درجه سانتی گراد (203 درجه فارنهایت) حاصل می شود. هر رشته الگویی است که یک رشته جدید بر روی آن ساخته می شود. در مرحله دوم، دما به حدود 55 درجه سانتی گراد (131 درجه فارنهایت) کاهش می یابد تا آغازگرها بتوانند تبدیل به قالب شوند. در مرحله سوم، دما به حدود 72 درجه سانتی گراد (162 درجه فارنهایت) رسیده و DNA پلیمراز شروع به افزودن نوکلئوتیدها به انتهای آغازگرهای بازپخت شده می کند. در پایان چرخه، که حدود پنج دقیقه طول می کشد، دما افزایش می یابد و روند دوباره شروع می شود. تعداد نسخه ها بعد از هر دوره دو برابر می شود. معمولاً 25 تا 30 چرخه مقدار کافی DNA تولید می کند.

مرحله 1 Denaturation  (دناتوراسیون)

همانند تکثیر DNA، دو رشته در مارپیچ دوگانه DNA باید جدا شوند. جداسازی با افزایش دمای مخلوط اتفاق می افتد و باعث می شود پیوندهای هیدروژن بین رشته های مکمل DNA شکسته شود. به این فرآیند دناتوراسیون گفته می شود. دمای واکنش تا 95 درجه سانتی گراد افزایش می یابد و پیوندهای هیدروژنی بین بازهای مکمل را مختل می کند.

مرحله 2 Annealing  (بازپخت)

آغازگرها به توالی های DNA هدف متصل شده و پلیمریزاسیون را آغاز می کنند. این تنها زمانی اتفاق می افتد که دمای محلول کاهش یابد. یک آغازگر به هر رشته متصل می شود. درجه حرارت حدود 5 درجه سانتی گراد زیر دمای ذوب  آغازگرها (اغلب 45-60 درجه سانتی گراد) کاهش می یابد تا اتصال آغازگر به الگو افزایش یابد.

مرحله 3Extension  (برنامه افزودنی)

رشته های جدید DNA با استفاده از رشته های اصلی به عنوان الگو ساخته می شوند. آنزیم DNA پلیمراز به نوکلئوتیدهای DNA آزاد پیوسته است. این آنزیم غالباً Taq polymerase است، آنزیمی که در اصل از باکتری گرمادوست به نام Thermus aquaticus جدا شده است. نتیجه یک چرخه PCR دو توالی دو رشته ای DNA هدف است که هر یک حاوی یک رشته تازه ساخته شده و یک رشته اصلی است. دما به 72 درجه سانتی گراد افزایش می یابد، که برای فعالیت DNA پلیمراز بهینه است تا اجازه دهد آغازگرهای ترکیبی گسترش یابند. این چرخه بارها تکرار می شود (معمولاً 20-30) زیرا بیشتر فرآیندهای استفاده از PCR به مقدار زیادی DNA احتیاج دارند. فقط 2 تا 3 ساعت طول می کشد تا یک میلیارد نسخه از آن را بدست آورید.