الکتروفورز دو بعدی | مفاهیم، روش ها و کاربردها

الکتروفورز دو بعدی

الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید دو بعدی و یا  2D-PAGEروشی برای جداسازی مخلوط های پروتئینی پیچیده است. هود لامینار در نظر بگیرید یک نمونه مجهول با تعداد نامشخصی از تنوع های پروتئینی در اختیار دارد. برای شناسایی پروتئین های نمونه مجهول چاره ای جز استفاده از روش الکتروفورز دو بعدی نخواهید داشت.  این روش جداسازی بسیار ساده و روتین است. تکنیک الکتروفورز دو بعدی به وسیله دو ویژگی مختلف پروتئین یعنی نقطه ایزوالکتریک و وزن مولکولی، طی دو مرحله صورت می گیرد.

منظور از الکتروفورز دو بعدی چیست؟

بعد ها در این تکنیک الکتروفورز ژل دوبعدی پروتئین ها به دو مرحله و دو ویژگی فیزیکی و شیمیایی پروتئین ها اشاره دارند. در بعد اول، پروتئین ها براساس نقطه ایزوالکتریک و در بعد دوم براساس وزن مولکولی نسبی از یکدیگر جدا می شوند.

تفاوت روش های الکتروفورز پروتئین

• روش SDS-PAGE یک تکنیک جداسازی یک بعدی است و پروتئین ها را بر اساس اندازه جدا می کند.
• الکتروفورز ژل دو بعدی، پروتئین ها را ابتدا بر اساس نقطه ایزوالکتریک و سپس بر اساس اندازه جدا می کند.

مراحل الکتروفورز دو بعدی پروتئین ها

در الکتروفورز دو بعدی پروتئین ها، ابتدا جداسازی صرفا بر اساس بار الکتریکی در یک میدان الکتریکی انجام می شود. با توجه به این که نقطه ایزوالکتریک پروتئین ها با یکدیگر متفاوت است، این جداسازی اهمیت پیدا می کند. در مرحله دوم، پروتئین ها یک بار دیگر به وسیله الکتروفورز عمودی تفکیک می شوند، اما این بار بر اساس جرم!

در ادامه، جزییات انجام این روش و مراحل آن ها به صورت کامل بررسی شده اند.

جداسازی پروتئین در بعد اول براساس نقطه ایزوالکتریک

پروتئین ها در مرحله isoelectric focusing (IEF) براساس نقطه ایزوالکترویک از یکدیگر جدا می شوند. نقطه ایزوالکتریک به عنوان pHای تعریف می شود که در آن بار خالص مولکول پروتئین صفر می باشد. در واقع براساس این تعریف اگر pH پروتئین کمتر از نقطه ایزوالکتریک باشد دارای بار مثبت و اگر بیشتر از نقطه ایزوالکتریک باشد دارای بار منفی است.

در این فرآیند مخلوط پروتئین تحت تاثیر میدان الکتریکی اعمال شده و بسته به بارها از هم جدا می ‌شوند. درواقع پروتئین ها براساس بار خود به سمت قطبین حرکت می کنند. پروتئین ها تا رسیدن به pH معادل نقطه ایزوالکتریک خود به حرکت ادامه می دهند. سپس آن ها با رسیدن به آن نقطه متمرکز شده و از مخلوط جدا می‌ شوند.

جداسازی پروتئین ها در بعد دوم براساس جرم مولکولی

پس از جداسازی در بعد اول، جداسازی در بعد دوم به وسیله دستگاه الکتروفورز عمودی، با تکنیک SDS-PAGE و بر اساس وزن مولکولی پروتئین ها صورت می گیرد.

در این تکنیک پروتئین ها به وسیله  SDSدناتوره می شوند و با استفاده از یک عامل کاهنده، مانند DTT پیوندهای دی سولفیدی شکسته و ساختار سوم پروتئین از بین می رود و به ساختاری خطی با بار منفی تبدیل می شود.

رنگ آمیزی و مشاهده پروتئین پس از جداسازی

می توان با نشاندار کردن پروتئین ها به وسیله اسیدهای آمینه نشاندار مانند 3H، 14C یا 35S و رنگ آمیزی آن ها با استفاده از کوماسی بلو، رنگ نقره، رنگ های فلورسنت و یا از طریق تشخیص رادیو ایزوتوپ (فسفرسانس) پروتیئن های جدا شده را مشاهده کرد. با استفاده از تکنیک الکتروفورز دو بعدی و رنگ آمیزی که ذکر شد، پروتئین های مختلف را می توان جدا کرد. در نهایت اطلاعاتی مانند نقطه ایزوالکتریک، وزن مولکولی و مقدار پروتئین را با این روش تعیین می شود.

نامگذاری پروتئین ها براساس باند

نامگذاری پروتئین ها به صورت باند براساس حرکت و جایگاه آن ها توسط دستگاه الکتروفورز و به روش   SDS-PAGE که مخفف Polyacrylamide gel electrophoresis Sodium dodecyl است انجام می شود. در این تکنیک پروتئین ها الکتروفورز شده و براساس اندازه در ژل قرار می گیرند. این نوع تکنیک به دلیل نوع ژل مورد نیاز که پلی آکریل آمید است با دستگاه الکتروفورز عمودی انجام می شود.

مراحل مورد نیاز به منظور نامگذاری پروتئین ها براساس باند

بار الکتریکی و اندازه مولکول ‌ها در جداسازی پروتئین ها به وسیله تکنیک الکتروفورز حائز اهمیت هستند. اگر با تکنیکی بتوانیم بار همه مولکول‌ های پروتئین را یکسان کنیم در این حالت جداسازی تنها براساس اندازه مولکول انجام می گیرد. با این روش فرآیند با دقت بالاتری نسبت به قبل انجام می شود.

در این روش با استفاده از حرارت دادن و اتصال دترجنت آنیونی به نام دودسیل سولفات  SDS که لوریل سولفات نیز نامیده می شود (SDS) به پروتئین‌ ها، بار همه مولکول‌ های پروتئینی منفی می‌ شود. ترکیب SDS به نواحی آبگریز پروتئین ‌ها متصل شده و آن ‌ها را دناتوره  می ‌کند. با این کار، در واقع SDS بار الکتریکی مولکول ‌های پروتئین را می ‌پوشاند و به این ترتیب، سرعت حرکت پروتئین ها تنها به اندازه آن ها بستگی دارد، نه به بار آن ها. بعد از این مرحله، با استفاده از  بستر پلی ‌آکریل آمید، پروتئین ‌ها در طول ماتریکس ژل براساس اندازه‌ شان از هم جدا می‌ شوند.

در تکنیک SDS-PAGE هر پروتئینی که وزنش کمتر باشد راحت تر از منافذ ژل عبور کرده و حرکت بیشتری در ژل خواهد داشت. در انتها هم پس از اتمام ژل، برای ظهور و پیدا شدن باند های پروتئین، رنگ آمیزی ژل اغلب با رنگ کوماسی بلو انجام  می شود.